近年来,腐植含砷灌溉水的酸调酸盐生菜使用导致砷污染农田大面出现,农田中的节砷砷进一步通过食物链传递对人体健康造成危害。砷的毒性生物毒性不仅取决于生物体中砷的含量,而且与砷的作用形态密切相关,砷可分为无机砷、研究有机砷和单质砷,腐植其中单质砷溶解度较低,酸调酸盐生菜不易被人体吸收,节砷而无机砷的毒性毒性大于有机砷。在土壤与水环境中,作用可溶性砷形态主要为砷酸盐As(Ⅴ)和亚砷酸盐As(Ⅲ),研究在有氧条件下,腐植As(Ⅴ)占主导地位,酸调酸盐生菜因此本研究选取砷酸盐作为主要研究对象。节砷生菜具有重要的食用价值和药用价值,现已成为设施农业和植物工厂的主要种植对象之一。本研究选取生菜作为研究对象,采用可以排除复杂土壤环境影响的水培方式,从砷酸盐的生菜积累以及对其安全品质影响方面开展研究。
腐植酸(Humicacid,HA)是一种天然存在的高络合和聚合有机物,其丰富的含氧官能团(例如羧酸、酚羟基和醌官能团可以络合许多金属。
采用的腐植酸中的黄腐酸(富里酸)含量≥90%,其分子结构中存在含氧活性基团,如羧基和酚羟基,同时还含有杂氮环,所以有离子交换性和与金属离子形成螯合物的能力,另外含有的醌基和半醌基具有一定的氧化还原能力。黄腐酸能使作物根系发达,次生根数量增多,提高作物吸水力,并能降低叶面蒸腾作用,提高叶绿素含量,促进光合作用。此外,腐植酸还可以提高植物肥力,改善植物生长。因此,本研究进一步选取腐植酸对砷的植物毒性进行调节,旨在从生菜中砷的安全限量的角度,探究蔬菜中砷的累积规律以及砷和腐植酸对蔬菜的毒性调节作用,为蔬菜质量安全及品质改善提供数据,对修订相关标准以及蔬菜的安全生产具有指导意义。
一、材料与方法
1、生菜的培养及染毒
本研究选取玻璃生菜(Lettuce(IcebergL)作为研究对象,采用蛭石将生菜种子培育至四叶一心后,移入水培盆中,每个水培盆种植生菜12株。各水培盆中均装有5L的Hoagland营养液,成分组成见表1。用NaOH调节pH为6.0,并及时补充蒸馏水至5L水位线,定期用充氧泵进行曝气处理,定期测定培养液中砷含量的变化。
为考察不同砷酸盐As(Ⅴ)初始添加浓度对生菜生长的影响,分别设置0.5、1、5、10、30mg·L-1的砷酸盐浓度(分别表示为V-0.5、V-1、V-5、V-10、V-30,V代表五价砷,由于V-30处理组在生菜生长至第10d全部死亡,因此不再作分析),同时设置空白对照组(CK),以及不添加植物空白对照组(NP)。
为研究腐植酸对生菜砷胁迫的影响,选取V-10处理组,分别添加1、5、10mg·L-1的腐植酸(分别表示为V10HA1、V10HA5、V10HA10,HA代表腐植酸),同时设置腐植酸的空白添加实验,在不添加砷的营养液中分别添加腐植酸5、10mg·L-1(1分别表示为CKHA5、CKHA10)。其中腐植酸分子式为C9H9NO6,CAS:1415-93-6,黄腐酸(富里酸)含量≥90%。为考察不同生长期生菜生长表现,分别在生菜生长早期(生长至第10d,Day10)、中期(生长至第20d,快速生长期,Day20)、收获期(生长至第30d,生长趋于稳定,Day30)时,随机选取生菜样品3株,采用便携式叶绿素仪(SPAD-502,MinoltaCamera,Osaka,Japan)对应测定叶片的SPAD(Soilandplantanalyzerdevelotrnent)值,每个处理组测定30次取平均值。采集生菜样品,分别进行植物鲜质量、株高、根长的测定。
2、pH、砷总量及砷形态的测定方法染毒前,统一调节各实验组中培养液pH为6.0。
在生菜3个对应生长期,进行pH测定,并进一步采集10mL培养液,进行适当稀释后,测定培养液中的砷总量及形态。
在生菜不同生长期,从每个处理组中随机采集生菜样品3株,使用陶瓷剪刀将其剪碎并混匀。同时各植株分别称取根、茎、叶样品2g,每个样品制备两份,其中一份用于生菜中砷形态的测定,将样品研磨后加入10mL提取剂(磷酸缓冲盐:2mmol·L-1磷酸氢二铵和0.2mmol·L-1EDTA),250r·min-1振荡20min,8000r·min-1离心5min,上清液经0.45μm水系滤膜过滤后,上机测定。另外一份置于消解管中,加入10mL浓硝酸过夜,置于电热消解仪上进行消解,升温至120℃加热0.5h,后升温至150℃继续加热3h,再调至170℃赶酸至0.5mL,待消煮管内液体冷却后定容至10mL,上机测定。
溶液及生菜中砷形态的测定采用HPLC-ICP-MS(HPLC:Agilent1100;ICP-MS:AgilentTechnologies7700Series),流动相为20mmol·L-1柠檬酸+5mmol·L-1己烷磺酸钠,采用NaOH调节pH为4.3,进样量为20μL,流速为1mL·min-1,测定过程中,通过添加质控、监控点以及复测方式进行质量控制。
3、生菜品质指标测定方法
为研究不同处理组在生菜快速生长期营养品质变化,采用维生素C、可溶性糖、硝酸盐、总酚测定试剂盒进行生菜品质指标的测定,试剂盒均由南京建成生物有限公司提供。氨基酸的测定采用SykamS433D型氨基酸自动分析仪进行,氨基酸的提取采用王丽的方法。
4、数据统计分析
除另有说明外,每个实验设置3个平行。采用SPSS22.0对数据进行单因素方差分析,通过T检验,当P<0.05时,认为具有显著差异。同时采用SIMCA14.1软件对氨基酸差异分布进行PLS-DA分析。
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