吸取6份平行羊肚菌样品供试溶液，测多测定进行衍生化处理，评法按上述的羊肚色谱条件进样测定，记录17种氨基酸（Asp、菌中基酸Glu、种氨Ser、测多测定Gly、评法His、羊肚Thr、菌中基酸Ala、种氨Arg、测多测定Pro、评法Tyr、羊肚Val、菌中基酸Met、种氨Ile、Leu、Phe、Trp、Lys）的峰面积，计算RSD值以考察实验的重复性。
取样品供试溶液，衍生化后，于0、2、4、8、16、24h进样分析，记录17种氨基酸（Asp、Glu、Ser、Gly、His、Thr、Ala、Arg、Pro、Tyr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Trp、Lys）的峰面积，计算RSD值以评价样品的稳定性。
精密称量已知含量的羊肚菌样品9份，每份10mg，置于安瓿瓶中，按150%、100%、50%的比例加入标准品，根据“1.2.2.1”操作后进行衍生化处理，在上述“1.2.3”的色谱条件下测定。根据测得的氨基酸的量，计算回收率和RSD值。
平行取3份云南羊肚菌样品溶液，进行衍生化处理，按上述的色谱条件测定。采用一测多评法和内标法对羊肚菌中17种氨基酸（Asp、Glu、Ser、Gly、His、Thr、Ala、Arg、Pro、Tyr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Trp、Lys）的含量进行计算。
精确吸取混合标准品溶液，进行衍生化处理后，在Agilent1100高效液相色谱仪，“1.2.3”的色谱条件下考察依利特HypersilODS2（250mm×4.6mm，5μm）和AgilentC18（250mm×4.6mm，5μm）对氨基酸相对校正因子的影响。
精密吸取混合对照品溶液，进行衍生化处理后，采用依利特HypersilODS2（250mm×4.6mm，5μm）在“1.2.3”色谱条件下，考察两台不同色谱仪Agilent1100HPLC、Agilent1260HPLC对氨基酸相对校正因子的影响。
精密吸取混合对照品溶液，进行衍生化处理后，采用依利特HypersilODS2（250mm×4.6mm，5μm）、AgilentC18（250mm×4.6mm，5μm），在Agilent1100HPLC、Agilent1260HPLC中测定并计算以Glu为内参物，其他氨基酸的相对保留时间。
精密称量6个不同地区的羊肚菌，按“1.2.2.1”方法制备样品供试溶液，进行衍生化处理，按“1.2.3”色谱条件进样分析，采用一测多评法对氨基酸进行含量计算。
应用IBMSPSSStatistics26.0软件进行t检验，实验谱图Originpro9.1处理。
在前期研究中，最初选择邻苯二甲醛为柱前衍生试剂，但衍生产物不稳定，实验的重现性较差。在文献调研后，选择了异硫氰酸苯酯为柱前衍生试剂，其反应条件温和、衍生产物性质稳定，重复性好。在前期的色谱条件研究中，考察了衍生时间对17种氨基酸出峰面积的影响。结果发现，衍生30min的出峰面积与衍生60min的出峰面积有一定差异，衍生30min时间较短，可能导致衍生不完全，影响含量测定的准确度；衍生90min与衍生60min的出峰面积一致，考虑效率问题，选择衍生时间为60min。
空白、标准品及样品的HPLC色谱图如图1所示。由图1可知，在“1.2.3”色谱条件下，17种氨基酸的峰型良好，干扰较少，分离清晰。
精密吸取不同浓度对照品溶液，衍生化处理后注入色谱仪，结果见表1。由表1可知，17种氨基酸在线性范围内与峰面积呈现良好的线性关系，相关系数R2＞0.9990。详见表1。
通过研究发现，苏氨酸、谷氨酸、赖氨酸和天冬氨酸在羊肚菌中的含量均较高且较稳定。但从质控成本角度来看，谷氨酸较其他三种成分价格更加低廉且附近干扰峰较少。根据QAMS法内参物易得、价廉、有效、稳定的选择原则，本研究最终选择谷氨酸作为内参物进行相对校正因子的计算。
以Glu为内参物，计算其与其他16种氨基酸的相对校正因子，结果表明，16种氨基酸的相对校正因子RSD≤1.73%，详见表2。
按“1.2.4.3”项下进行试验，结果显示，17种氨基酸（Asp、Glu、Ser、Gly、His、Thr、Ala、Arg、Pro、Tyr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Trp、Lys）的峰面积RSD（n=6）为0.89%、0.46%、1.08%、0.61%、1.17%、0.31%、0.50%、0.80%、0.80%、1.89%、0.45%、0.52%、0.90%、0.53%、0.88%、0.54%、0.57%，RSD均小于2.0%，表示仪器的精密度良好。
按“1.2.4.4”项方法进行测定，结果显示，17种氨基酸峰（Asp、Glu、Ser、Gly、His、Thr、Ala、Arg、Pro、Tyr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Trp、Lys）面积的RSD为0.56%、1.72%、1.87%、0.42%、1.53%、1.85%、1.49%、0.80%、0.93%、1.68%、0.60%、1.17%、0.92%、1.48%、0.77%、0.96%、1.65%，RSD均小于2.0%，表明该方法具有较好的重复性。
按“1.2.4.5”项方法进行测定，结果显示，17种氨基酸（Asp、Glu、Ser、Gly、His、Thr、Ala、Arg、Pro、Tyr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Trp、Lys）峰面积的RSD为0.63%、1.48%、0.99%、1.37%、1.03%、1.49%、1.02%、1.41%、0.78%、0.67%、1.32%、1.24%、1.38%、0.75%、1.54%、1.24%、0.75%，RSD均小于2.0%，说明样品供试溶液在24h内稳定。
按“1.2.4.6”项下进行试验，结果表明，羊肚菌中17种氨基酸的平均回收率在92.42%～101.16%之间，RSD<2.0%，说明氨基酸的回收率较好。详见表3。
相关链接：苏氨酸，邻苯二甲醛，异硫氰酸苯酯，谷氨酸
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