吸取6份平行羊肚菌样品供试溶液,测多测定进行衍生化处理,评法按上述的羊肚色谱条件进样测定,记录17种氨基酸(Asp、菌中基酸Glu、种氨Ser、测多测定Gly、评法His、羊肚Thr、菌中基酸Ala、种氨Arg、测多测定Pro、评法Tyr、羊肚Val、菌中基酸Met、种氨Ile、Leu、Phe、Trp、Lys)的峰面积,计算RSD值以考察实验的重复性。
取样品供试溶液,衍生化后,于0、2、4、8、16、24h进样分析,记录17种氨基酸(Asp、Glu、Ser、Gly、His、Thr、Ala、Arg、Pro、Tyr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Trp、Lys)的峰面积,计算RSD值以评价样品的稳定性。
精密称量已知含量的羊肚菌样品9份,每份10mg,置于安瓿瓶中,按150%、100%、50%的比例加入标准品,根据“1.2.2.1”操作后进行衍生化处理,在上述“1.2.3”的色谱条件下测定。根据测得的氨基酸的量,计算回收率和RSD值。
平行取3份云南羊肚菌样品溶液,进行衍生化处理,按上述的色谱条件测定。采用一测多评法和内标法对羊肚菌中17种氨基酸(Asp、Glu、Ser、Gly、His、Thr、Ala、Arg、Pro、Tyr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Trp、Lys)的含量进行计算。
精确吸取混合标准品溶液,进行衍生化处理后,在Agilent1100高效液相色谱仪,“1.2.3”的色谱条件下考察依利特HypersilODS2(250mm×4.6mm,5μm)和AgilentC18(250mm×4.6mm,5μm)对氨基酸相对校正因子的影响。
精密吸取混合对照品溶液,进行衍生化处理后,采用依利特HypersilODS2(250mm×4.6mm,5μm)在“1.2.3”色谱条件下,考察两台不同色谱仪Agilent1100HPLC、Agilent1260HPLC对氨基酸相对校正因子的影响。
精密吸取混合对照品溶液,进行衍生化处理后,采用依利特HypersilODS2(250mm×4.6mm,5μm)、AgilentC18(250mm×4.6mm,5μm),在Agilent1100HPLC、Agilent1260HPLC中测定并计算以Glu为内参物,其他氨基酸的相对保留时间。
精密称量6个不同地区的羊肚菌,按“1.2.2.1”方法制备样品供试溶液,进行衍生化处理,按“1.2.3”色谱条件进样分析,采用一测多评法对氨基酸进行含量计算。
应用IBMSPSSStatistics26.0软件进行t检验,实验谱图Originpro9.1处理。
在前期研究中,最初选择邻苯二甲醛为柱前衍生试剂,但衍生产物不稳定,实验的重现性较差。在文献调研后,选择了异硫氰酸苯酯为柱前衍生试剂,其反应条件温和、衍生产物性质稳定,重复性好。在前期的色谱条件研究中,考察了衍生时间对17种氨基酸出峰面积的影响。结果发现,衍生30min的出峰面积与衍生60min的出峰面积有一定差异,衍生30min时间较短,可能导致衍生不完全,影响含量测定的准确度;衍生90min与衍生60min的出峰面积一致,考虑效率问题,选择衍生时间为60min。
空白、标准品及样品的HPLC色谱图如图1所示。由图1可知,在“1.2.3”色谱条件下,17种氨基酸的峰型良好,干扰较少,分离清晰。
精密吸取不同浓度对照品溶液,衍生化处理后注入色谱仪,结果见表1。由表1可知,17种氨基酸在线性范围内与峰面积呈现良好的线性关系,相关系数R2>0.9990。详见表1。
通过研究发现,苏氨酸、谷氨酸、赖氨酸和天冬氨酸在羊肚菌中的含量均较高且较稳定。但从质控成本角度来看,谷氨酸较其他三种成分价格更加低廉且附近干扰峰较少。根据QAMS法内参物易得、价廉、有效、稳定的选择原则,本研究最终选择谷氨酸作为内参物进行相对校正因子的计算。
以Glu为内参物,计算其与其他16种氨基酸的相对校正因子,结果表明,16种氨基酸的相对校正因子RSD≤1.73%,详见表2。
按“1.2.4.3”项下进行试验,结果显示,17种氨基酸(Asp、Glu、Ser、Gly、His、Thr、Ala、Arg、Pro、Tyr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Trp、Lys)的峰面积RSD(n=6)为0.89%、0.46%、1.08%、0.61%、1.17%、0.31%、0.50%、0.80%、0.80%、1.89%、0.45%、0.52%、0.90%、0.53%、0.88%、0.54%、0.57%,RSD均小于2.0%,表示仪器的精密度良好。
按“1.2.4.4”项方法进行测定,结果显示,17种氨基酸峰(Asp、Glu、Ser、Gly、His、Thr、Ala、Arg、Pro、Tyr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Trp、Lys)面积的RSD为0.56%、1.72%、1.87%、0.42%、1.53%、1.85%、1.49%、0.80%、0.93%、1.68%、0.60%、1.17%、0.92%、1.48%、0.77%、0.96%、1.65%,RSD均小于2.0%,表明该方法具有较好的重复性。
按“1.2.4.5”项方法进行测定,结果显示,17种氨基酸(Asp、Glu、Ser、Gly、His、Thr、Ala、Arg、Pro、Tyr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Trp、Lys)峰面积的RSD为0.63%、1.48%、0.99%、1.37%、1.03%、1.49%、1.02%、1.41%、0.78%、0.67%、1.32%、1.24%、1.38%、0.75%、1.54%、1.24%、0.75%,RSD均小于2.0%,说明样品供试溶液在24h内稳定。
按“1.2.4.6”项下进行试验,结果表明,羊肚菌中17种氨基酸的平均回收率在92.42%~101.16%之间,RSD<2.0%,说明氨基酸的回收率较好。详见表3。
相关链接:苏氨酸,邻苯二甲醛,异硫氰酸苯酯,谷氨酸
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